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ELISA 實(shí)驗(yàn)的一些原理總結(jié)

更新時(shí)間:2021-12-13    點(diǎn)擊次數(shù):1692

  ELISA 實(shí)驗(yàn)的一些原理總結(jié)


  ELISA  即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,是一類常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,然后利用酶標(biāo)記(偶聯(lián))的抗體或抗原與之孵育,加入顯色劑顯色,通過酶標(biāo)儀測(cè)定待測(cè)物顏色與標(biāo)準(zhǔn)物顏色的差異,繪制出酶活曲線得出待測(cè)物濃度。

  ELISA 可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。ELISA 實(shí)驗(yàn)中有三種必要的試劑:

  ① 固相的抗原或抗體(用于結(jié)合到固相載體上)

 ?、?標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物)

  ③ 作用的底物(顯色劑,用于顯色)

  四種常見 ELISA方法

  1. 直接 ELISA

  將抗原固定于 ELISA 板上,然后用酶標(biāo)抗體直檢測(cè)抗原。

  相較于其它類型的 ELISA 實(shí)驗(yàn),直接 ELISA 實(shí)驗(yàn)步驟少,檢測(cè)速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反應(yīng),測(cè)定結(jié)果不容易出錯(cuò)。但是由于直接  ELISA 的抗原不是特異性固定的,樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與 ELISA 板結(jié)合,實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高。而且直接 ELISA  每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,實(shí)驗(yàn)不太靈活。另外由于沒有使用二抗,信號(hào)沒有被放大,降低了測(cè)定的靈敏度。

  2. 間接 ELISA

  先將抗原結(jié)合到 ELISA 板上,隨后分兩步進(jìn)行檢測(cè):首先加入檢測(cè)抗體與抗原特異性結(jié)合,隨后加入酶標(biāo)二抗檢測(cè)并利用底物顯色。

  與直接 ELISA 相比,間接 ELISA 用到酶標(biāo)二抗,具有更高的靈敏度,也需要更少的標(biāo)記抗體,更經(jīng)濟(jì)。間接 ELISA  還提供了更大的靈活性,因?yàn)椴煌囊豢鼓軌蚺c單一標(biāo)記的二抗一同使用。間接 ELISA  實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是存在交叉反應(yīng)的可能性(酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合),可能會(huì)增加背景,同時(shí)與直接 ELISA 相比,間接 ELISA  實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟,實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)。

  3. 夾心 ELISA

  先將捕獲抗體固定于 ELISA 板孔中,然后加入樣品,接著加入檢測(cè)抗體。如果檢測(cè)抗體是酶標(biāo)抗體,則可稱為直接夾心  ELISA;如果檢測(cè)抗體不帶有標(biāo)記,則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體結(jié)合,這種稱為間接夾心 ELISA。

  夾心 ELISA 的靈敏度高,它比直接或間接 ELISA 敏感 2-5 倍;同時(shí)夾心 ELISA  使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合,擁有很高的特異性。另外夾心 ELISA 能夠通過直接或間接的方式進(jìn)行檢測(cè),靈活性較高。夾心 ELISA  的缺點(diǎn)是對(duì)配對(duì)抗體要求很高,如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測(cè)試的配對(duì)抗體,則需要進(jìn)行配對(duì)抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化,因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測(cè)抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。

  4. 競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法

  預(yù)先將抗原包被在固相載體上,并加入酶標(biāo)記的特異性抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí),加入待檢抗原(或抗體),如果待檢物是抗原,則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體;如果待檢測(cè)物是抗體,則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的酶標(biāo)抗體,加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。

  競(jìng)爭(zhēng) ELISA 相對(duì)以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些,但以上三種 ELISA 類型都適用于競(jìng)爭(zhēng) ELISA  的形式。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可檢測(cè)不純的樣品,且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,但存在整體敏感性和專一性較差的問題。

  ELISA 常見問題與解決方法

  1. 陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性結(jié)果

  ① 樣品、試劑被污染,或加樣時(shí)操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,小心操作。

 ?、?酶標(biāo)板洗滌不——洗板前先將抗體溶液倒干凈,然后清洗液倒?jié)M板孔,確保能充分洗滌。

 ?、?抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體,稀釋抗體到適當(dāng)濃度。

  2.酶標(biāo)板整體背景高

 ?、?抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

 ?、?底物結(jié)合濃度過高——對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

 ?、?反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng),適當(dāng)縮短顯色時(shí)間。

 ?、?底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的,若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,應(yīng)更換新的底物溶液。

 ?、?底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。

  3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

 ?、?樣品數(shù)量不整齊,加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短——加重復(fù)孔時(shí)盡量保持加樣時(shí)間與接近。

 ?、?加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,并且使用同一移液槍。

 ?、?洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測(cè)定樣品時(shí),操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

  4. 吸光值偏高或偏低

  ① 樣品中待測(cè)抗原含量太低會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

 ?、?加入抗體量不合適會(huì)造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或?yàn)榱耸菇Y(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的用量。

 ?、?孵育時(shí)間太短導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低——適當(dāng)延長(zhǎng)抗體或抗原的孵育時(shí)間,確保待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體能充分結(jié)合。

 ?、?孵育溫度不適合——應(yīng)抗體在最適宜條件下進(jìn)行孵育(一般 37℃ 孵育 1h )。

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