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冰凍切片DAB顯色原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟

更新時(shí)間:2024-01-08    點(diǎn)擊次數(shù):2580

  冰凍切片DAB顯色原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟

  1.組織固定:組織取出PBS漂洗后立即放入原位雜交固定液(動(dòng)物)中固定12h以上,4°保存運(yùn)輸。

  2.脫水:固定后在通風(fēng)櫥內(nèi)切取目的區(qū)域組織塊約3mm厚,放入15%蔗糖溶液中8h,后換30%蔗糖溶液中過夜。

  3.冰凍切片固定:冰凍切片室溫晾干,置于原位雜交固定液(動(dòng)物)固定10min,于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

  4.修復(fù)及消化:根據(jù)組織類型,固定時(shí)間長短及指標(biāo)的定位,選用不同的修復(fù)液進(jìn)行修復(fù),具體修復(fù)條件見上表。自然冷卻后組化筆畫圈,根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化,消化時(shí)間見上表。純水沖洗后PBS洗3次,每次5min。

  5.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

  6.預(yù)雜交:滴加預(yù)雜交液,37°C孵育1h。

  7.雜交:傾去預(yù)雜交液,滴加含探針雜交液, 恒溫箱雜交過夜。雜交條件見上表。

  8.雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。

  9.血清封閉:滴加封閉血清正常兔血清 室溫孵育30min。

  10.滴加HRP標(biāo)記鼠抗digaoxin抗體(anti-DIG-HRP):傾去血清封閉液,滴加anti-DIG-HRP。37° 孵育50min,后PBS洗4次×5min。

  11.DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時(shí)間,陽性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色。

  12.復(fù)染細(xì)胞核:蘇木素染液復(fù)染3min左右,自來水洗,蘇木素分化液分化數(shù)秒,自來水洗,蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)1min,流水沖洗。

  13.脫水封片:將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I(xiàn) 6min—100%酒精I(xiàn)I 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,將切片從二甲苯中拿出稍晾干后,封片劑封片。

  14.顯微鏡檢,圖像采集分析。

  術(shù)原理介紹

  采用digaoxin標(biāo)記特異性的寡核苷酸序列作為探針。利用HRP(過氧化物酶)標(biāo)記的抗digaoxin抗體與digaoxin標(biāo)記的核酸雜交體結(jié)合。然后HRP催化DAB(二氨基聯(lián)苯胺)生成不溶于水的棕黃色產(chǎn)物,實(shí)現(xiàn)靶基因-探針雜交體的定位和定量。

  本產(chǎn)品僅供科研用途,不用于臨床診斷!

  注:以上資料僅供參考!

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